ANO4 Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-406887-LAC-2

Il gene umano ANO4 codifica l’anoctamina-4, un membro della famiglia TMEM16/anoctamine di proteine di membrana multipasso, implicate nel trasporto ionico regolato dal calcio e nello scrambling (rimescolamento) dei fosfolipidi nelle membrane cellulari. L’attività di ANO4 è collegata alla regolazione del potenziale di membrana, alla segnalazione intracellulare Ca²⁺-dipendente e a eventi di rimodellamento che influenzano il traffico vescicolare, l’apoptosi e l’eccitabilità cellulare. Un’espressione alterata o una disfunzione delle proteine della famiglia TMEM16, inclusa ANO4, è stata associata a fenotipi neurologici e ad altri fenotipi complessi, a supporto del suo studio nei meccanismi di neurodegenerazione e dell’omeostasi tissutale. Studi di editing del gene ANO4 e di perturbazione funzionale consentono di analizzare le vie di segnalazione in sistemi modello, includendo saggi elettrofisiologici e di scrambling lipidico, per mappare le reti di segnalazione a valle e le relazioni genotipo–fenotipo.

Le particelle di attivazione lentivirale ANO4 (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ANO4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale ANO4 (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ANO4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di ANO4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ANO4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.