Amylase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400533-ACT

AMY2A codifica un’α-amilasi pancreatica secreta che avvia la digestione dei carboidrati idrolizzando i legami glicosidici α-1,4 nell’amido alimentare e nel glicogeno, generando maltosio e oligosaccaridi. La sua espressione e secrezione sono strettamente legate alla differenziazione del pancreas esocrino e alla biologia della via secretoria regolata, integrando programmi trascrizionali responsivi ai nutrienti con il traffico dei granuli di zimogeno. Una produzione alterata di amilasi è comunemente utilizzata come indicatore funzionale dello stato delle cellule acinose pancreatiche e dell’omeostasi degli enzimi digestivi, e AMY2A viene studiato in contesti in cui la funzione esocrina è perturbata, inclusi l’infiammazione pancreatica e più ampie alterazioni della regolazione degli enzimi digestivi. In quanto enzima secreto ad alta espressione, AMY2A funge anche da locus modello per indagare il controllo trascrizionale delle proteine secrete e l’identità delle cellule acinose.

Amylase 2a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AMY2A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Amylase 2a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AMY2A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AMY2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Amylase 2a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AMY2A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Amylase 2a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Amylase 2a nelle cellule tumorali con espressione di AMY2A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.