Ameloblastin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403086-ACT

AMBN codifica l’ameloblastina, una glicoproteina secreta della matrice extracellulare altamente arricchita durante la formazione dello smalto, che contribuisce all’adesione degli ameloblasti, alla loro polarità e a una deposizione minerale controllata. L’ameloblastina partecipa alla segnalazione matrice–cellula e coordina la differenziazione dell’organo dello smalto modulando l’organizzazione della matrice extracellulare e i relativi programmi di sviluppo epiteliale. Oltre ai ruoli nella morfogenesi dentale, l’espressione di AMBN è stata collegata alla regolazione della migrazione e della differenziazione cellulare in contesti di tessuti mineralizzati, rendendola rilevante per studi sullo sviluppo craniofacciale e sull’integrità strutturale dello smalto. Un’attività o un’espressione disregolata di AMBN è quindi di interesse per indagare i meccanismi molecolari alla base dei difetti dello smalto e, più in generale, le interazioni tra epitelio e matrice.

Ameloblastin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AMBN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ameloblastin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AMBN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AMBN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ameloblastin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AMBN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ameloblastin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ameloblastin nelle cellule tumorali con espressione di AMBN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.