ALKBH8 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-426676-ACT

Il gene murino **Alkbh8** codifica **ALKBH8**, un enzima di modificazione dei tRNA che sostiene la fedeltà della traduzione catalizzando passaggi chiave nella chimica dell’uridina wobble, inclusi metilazione e modifiche ossidative che influenzano la decodifica dei codoni. Attraverso la regolazione dell’efficienza di decodifica dipendente dai tRNA, ALKBH8 incide sull’omeostasi proteica e sulle vie di adattamento cellulare allo stress, in particolare in condizioni ossidative e genotossiche. Alterazioni dell’attività di ALKBH8 sono state associate a paesaggi di modificazione dell’RNA deregolati, che possono influenzare la stabilità del genoma, la segnalazione della risposta allo stress e programmi di sopravvivenza cellulare rilevanti per la biologia del cancro e per modelli di lesione tissutale infiammatoria. In quanto nodo del controllo epitranscrittomico della traduzione, **Alkbh8** è frequentemente studiato nel contesto dell’equilibrio redox, delle risposte al danno al DNA e dei fenotipi associati alla proteostasi.

ALKBH8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Alkbh8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ALKBH8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Alkbh8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Alkbh8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ALKBH8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Alkbh8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ALKBH8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ALKBH8 nelle cellule tumorali con espressione di Alkbh8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.