ALKBH5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-435243-ACT

Mouse Alkbh5 codifica ALKBH5, una demetilasi dell’RNA dipendente da Fe(II)/α-chetoglutarato che rimuove le modifiche N6-metiladenosina (m6A) per regolare stabilità dell’RNA, splicing, esportazione nucleare e traduzione. Modellando gli stati epitranscrittomici, ALKBH5 influenza programmi di espressione genica che controllano proliferazione e differenziamento cellulare, risposte allo stress e processi di sviluppo. L’attività di ALKBH5 interagisce con le vie dei “writer” e dei “reader” dell’m6A per modulare il destino dei trascritti nel nucleo e nel citoplasma. In letteratura, una dinamica dell’m6A deregolata che coinvolge ALKBH5 è stata collegata ad alterazioni delle transizioni di stato cellulare e a fenotipi associati a malattia, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici sul metabolismo dell’RNA.

ALKBH5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Alkbh5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ALKBH5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Alkbh5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Alkbh5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ALKBH5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Alkbh5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ALKBH5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ALKBH5 nelle cellule tumorali con espressione di Alkbh5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.