ALG2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410220-ACT

ALG2 umano codifica una manosiltransferasi associata al reticolo endoplasmatico che catalizza l’aggiunta sequenziale di residui di mannosio durante l’assemblaggio del precursore oligosaccaridico legato a lipide, necessario per la glicosilazione N-linked. Attraverso il suo ruolo nella via del dolicolo e nel controllo qualità del RE, ALG2 favorisce il corretto ripiegamento proteico, il traffico intracellulare e la maturazione delle glicoproteine in proteine secretorie e di membrana. L’alterazione delle fasi precoci della biosintesi degli N-glicani può innescare risposte di stress del RE e ampie modifiche della funzione dei recettori di superficie e delle reti di segnalazione. La glicosilazione aberrante è stata implicata in diversi fenotipi patologici, rendendo ALG2 un nodo utile per studiare la glicoproteostasi, la biologia della via secretoria e le funzioni cellulari dipendenti dai glicani nei sistemi umani.

ALG2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALG2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ALG2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALG2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALG2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ALG2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALG2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ALG2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ALG2 nelle cellule tumorali con espressione di ALG2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.