AKAP 95 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403651-ACT

AKAP8 umano codifica la proteina di ancoraggio della A-chinasi 95 (AKAP 95), un’impalcatura nucleare che organizza spazialmente la proteina chinasi A e altri complessi regolatori per coordinare la segnalazione dipendente dalla fosforilazione nella cromatina. AKAP 95 partecipa al processamento dell’RNA e al controllo trascrizionale attraverso interazioni con componenti della matrice nucleare e fattori associati allo splicing, collegando l’architettura nucleare ai programmi di espressione genica. È stata implicata nella progressione del ciclo cellulare e nella regolazione del genoma, risultando quindi rilevante per studi sulla segnalazione proliferativa e sulle reti trascrizionali deregolate osservate nel cancro e in altri disturbi associati alla crescita.

AKAP 95 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKAP8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AKAP 95 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKAP8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKAP8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AKAP 95. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKAP8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AKAP 95 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AKAP 95 nelle cellule tumorali con espressione di AKAP8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.