AKAP 79 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402647-ACT

AKAP5 umano codifica la proteina di ancoraggio della A-chinasi 79 (AKAP79), una proteina scaffold associata alla membrana che organizza spazialmente la PKA insieme a enzimi chiave della segnalazione, tra cui PP2B/calcineurina e PKC, modulando la fosforilazione in modo dipendente dallo stimolo. Ancorando questi complessi in prossimità di recettori e canali ionici, AKAP79 regola la segnalazione compartimentalizzata dipendente da cAMP e Ca2+, la plasticità sinaptica e il rimodellamento attività-dipendente delle sinapsi eccitatorie. La segnalazione associata ad AKAP79 influenza la funzione dei recettori AMPA e NMDA e i programmi trascrizionali a valle che controllano l’eccitabilità neuronale. La disregolazione degli hub di segnalazione collegati ad AKAP5 è stata implicata in meccanismi di malattie neurologiche e psichiatriche, in cui alterazioni della segnalazione sinaptica e dell’equilibrio delle vie Ca2+/cAMP contribuiscono alla fisiopatologia.

AKAP 79 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKAP5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AKAP 79 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKAP5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKAP5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AKAP 79. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKAP5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AKAP 79 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AKAP 79 nelle cellule tumorali con espressione di AKAP5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.