AKAP 12 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406008-ACT

AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12; gravin) è una proteina scaffold che organizza spazialmente la segnalazione di PKA e PKC a livello della membrana plasmatica e del citoscheletro, coordinando la desensibilizzazione dei recettori, il rimodellamento del citoscheletro e il controllo del ciclo cellulare. Ancorando chinasi e fosfatasi in prossimità di GPCR e integrine, AKAP12 influenza vie che regolano la dinamica delle adesioni focali, la migrazione cellulare e la funzione di barriera, con effetti a valle sulla segnalazione MAPK e dipendente da cAMP. Alterazioni dell’espressione di AKAP12 e della sua regolazione epigenetica sono state collegate a cambiamenti nei programmi di adesione e motilità cellulare rilevanti per la biologia del cancro, la disfunzione vascolare e i microambienti infiammatori. Queste proprietà rendono AKAP12 un nodo utile per studiare la compartimentalizzazione dei segnali e le risposte trascrizionali dipendenti dal contesto nelle cellule umane.

AKAP 12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKAP12 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AKAP 12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKAP12 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKAP12, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AKAP 12. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKAP12 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AKAP 12 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AKAP 12 nelle cellule tumorali con espressione di AKAP12 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.