AIP4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401677-ACT

L’ITCH umano codifica l’E3 ubiquitina ligasi di tipo HECT AIP4, un regolatore chiave del turnover proteico che controlla la durata dei segnali catalizzando l’ubiquitinazione e il successivo indirizzamento di specifici substrati al proteasoma o al compartimento lisosomiale. AIP4 modula molteplici vie, tra cui la segnalazione del recettore dei linfociti T, le vie NF-κB e MAPK e la dinamica della via TGF-β/SMAD, influenzando così l’omeostasi immunitaria, l’infiammazione e le risposte allo stress cellulare. Regolando la stabilità e il traffico di recettori e adattatori di segnalazione, ITCH incide su apoptosi, differenziamento e programmi associati alla transizione epitelio-mesenchimale. Un’attività o un’espressione deregolate di ITCH sono state collegate a fenotipi di disregolazione immunitaria e ad alterazioni delle reti di segnalazione oncogenica, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul controllo delle vie dipendenti dall’ubiquitina.

AIP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITCH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AIP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITCH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITCH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AIP4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITCH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AIP4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AIP4 nelle cellule tumorali con espressione di ITCH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.