AFP/Alpha fetoprotein Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400355-ACT

AFP codifica per l’alfa-fetoproteina, una principale glicoproteina oncofetale secreta prodotta prevalentemente dal fegato fetale e dal sacco vitellino e la cui espressione viene ridotta dopo la nascita. L’AFP contribuisce ai programmi di sviluppo sostenendo la differenziazione degli epatoblasti e modulando segnali extracellulari che influenzano proliferazione e sopravvivenza. Nei tessuti adulti, la ri-espressione aberrante di AFP è associata alla de-differenziazione della linea epatocellulare e a stati trascrizionali alterati osservati nelle neoplasie epatiche e in disturbi correlati del fegato. In quanto proteina secreta di tipo biomarcatore, l’AFP è spesso utilizzata per studiare lo sviluppo del fegato, le transizioni dello stato cellulare epatico e i fenotipi secretori associati ai tumori.

AFP/Alpha fetoprotein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AFP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AFP/Alpha fetoprotein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AFP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AFP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AFP/Alpha fetoprotein. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AFP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AFP/Alpha fetoprotein nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AFP/Alpha fetoprotein nelle cellule tumorali con espressione di AFP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.