Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430515-ACT

Il gene murino Adcy3 codifica l’adenilato ciclasi 3 (AC3/ADCY3), un enzima associato alla membrana che converte l’ATP in cAMP, collegando la segnalazione dei GPCR alle vie effettrici a valle mediate da PKA ed EPAC. La produzione di cAMP dipendente da ADCY3 modella programmi trascrizionali dipendenti dallo stimolo tramite CREB e contribuisce a coordinare risposte cellulari quali il sensing metabolico, la segnalazione neuroendocrina e processi secretori regolati e neuronali. Nel topo, la funzione di Adcy3 è spesso studiata in contesti in cui la dinamica del cAMP controlla il bilancio energetico e la trasduzione sensoriale, fornendo collegamenti meccanicistici con fenotipi legati all’obesità e con una più ampia disregolazione metabolica. In quanto hub di segnalazione, ADCY3 è inoltre rilevante per analizzare il crosstalk tra input dei GPCR e il controllo dell’espressione genica mediato dai secondi messaggeri.

Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Adcy3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Adcy3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Adcy3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Adcy3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 nelle cellule tumorali con espressione di Adcy3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.