adenosine deaminase Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402201-LAC

L’ADA umano codifica l’adenosina deaminasi, un enzima chiave del metabolismo delle purine che deamina in modo irreversibile l’adenosina e la deossiadenosina in inosina e deossiinosina, regolando così i pool di adenosina intra- ed extracellulari. Controllando l’equilibrio dei nucleosidi che influenzano la sintesi del DNA, l’omeostasi energetica e la segnalazione tramite le vie dei recettori dell’adenosina, l’ADA contribuisce allo sviluppo dei linfociti e, più in generale, alla funzione delle cellule immunitarie. Un’attività dell’ADA deregolata perturba il catabolismo delle purine e può alterare il turnover dei nucleotidi, l’equilibrio redox e i programmi di segnalazione infiammatoria. Per questo l’ADA è ampiamente studiata in modelli di immunodeficienza, attivazione immunitaria e stress metabolico, in cui il flusso delle purine e la segnalazione mediata dall’adenosina sono variabili centrali.

Le particelle di attivazione lentivirale adenosine deaminase (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ADA in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale adenosine deaminase (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ADA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di adenosine deaminase. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ADA e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.