ACTG2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400007-ACT

ACTG2 kodiert Gamma-2-Aktin der glatten Muskulatur, einen zentralen Bestandteil des kontraktilen Apparats in viszeralen glatten Muskelzellen. Dort polymerisiert es zu Aktinfilamenten, die die Kraftentwicklung und die Integrität des Zytoskeletts unterstützen. ACTG2 ist an der Aktomyosin-Dynamik sowie an zytoskelettabhängigen Prozessen beteiligt, darunter die Kontraktion der glatten Muskulatur, die Kontrolle der Zellform und die Mechanotransduktion, und interagiert funktionell mit Myosin und Aktin-bindenden Proteinen in RhoA/ROCK-regulierten Signalwegen. Eine veränderte ACTG2-Expression oder -Funktion wird mit beeinträchtigten Motilitäts-Phänotypen der glatten Muskulatur im Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt in Verbindung gebracht und wurde als Faktor im Spektrum kongenitaler viszeraler Myopathien impliciert. Als linien- und zustandsassoziierter Marker der glatten Muskulatur wird ACTG2 zudem eingesetzt, um Differenzierungsprogramme, zytoskelettales Remodeling und kontraktilitätsgetriebene zelluläre Phänotypen zu untersuchen.

ACTG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACTG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACTG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACTG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACTG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACTG2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACTG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACTG2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACTG2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACTG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.