ACOT8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407262-ACT

L’ACOT8 umano codifica una tioesterasi perossisomiale dell’acil‑coenzima A che idrolizza gli esteri acil‑CoA in acidi grassi liberi e CoA, contribuendo a bilanciare i pool di acil‑CoA e a mantenere la disponibilità di CoA. Regolando la gestione dei lipidi nel perossisoma, ACOT8 influenza la β‑ossidazione degli acidi grassi, il rimodellamento lipidico e l’omeostasi redox collegata al metabolismo perossisomiale che produce perossido di idrogeno. L’attività di ACOT8 si integra con programmi metabolici più ampi che coordinano il crosstalk tra perossisomi e mitocondri e le risposte cellulari allo stress nutrizionale e ossidativo. Alterazioni del metabolismo lipidico perossisomiale e dell’omeostasi del CoA sono rilevanti per la disfunzione metabolica e per la biologia delle patologie associate ai perossisomi, supportando l’uso di ACOT8 come bersaglio in studi su fenotipi cellulari guidati dai lipidi.

ACOT8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACOT8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ACOT8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACOT8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACOT8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ACOT8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACOT8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ACOT8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ACOT8 nelle cellule tumorali con espressione di ACOT8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.