ACAP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405104-ACT

ACAP1 (ArfGAP con domini a coiled-coil, ripetizioni di anchirina e domini PH 1) codifica una proteina attivatrice della GTPasi regolata da ARF6 che collega il legame ai fosfoinositidi agli eventi di traffico di membrana. ACAP1 funziona nel riciclo endocitico associato alla clatrina, contribuendo a controllare lo smistamento del carico e il ritorno di recettori e molecole di adesione alla membrana plasmatica, influenzando così la polarità cellulare, la migrazione e la dinamica della segnalazione. Attraverso i suoi ruoli negli endosomi di riciclo e nel traffico legato all’actina, ACAP1 è rilevante per vie che regolano il turnover dei recettori, l’adesione dipendente dalle integrine e il rimodellamento della membrana nelle cellule immunitarie. Un riciclo endosomiale deregolato e l’attività della rete di ARF6 sono stati implicati nella segnalazione oncogenica, in fenotipi associati all’invasione e in disfunzioni immunitarie, rendendo ACAP1 un nodo utile per studi meccanicistici della regolazione dipendente dal traffico.

ACAP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACAP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ACAP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACAP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACAP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ACAP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACAP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ACAP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ACAP1 nelle cellule tumorali con espressione di ACAP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.