AATM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403969-ACT

Il gene umano **GOT2** codifica l’aspartato aminotransferasi mitocondriale (AATM), un enzima dipendente dal fosfato di piridossale che catalizza la transaminazione reversibile tra glutammato/ossalacetato e aspartato/α-chetoglutarato. L’AATM è un componente fondamentale della navetta malato–aspartato, che accoppia l’equilibrio redox citosolico e mitocondriale trasferendo equivalenti riducenti nei mitocondri e sostenendo l’omeostasi NADH/NAD⁺. Attraverso i suoi ruoli nel metabolismo degli amminoacidi, nell’anaplerosi del ciclo TCA e nella gestione dell’azoto, GOT2 influenza la bioenergetica mitocondriale e la disponibilità di aspartato necessaria per la sintesi dei nucleotidi. La disregolazione delle vie collegate a GOT2 è stata associata a stati metabolici alterati osservati in cellule proliferative e adattate allo stress, rendendolo rilevante per studi sul rimodellamento metabolico e sulla funzione mitocondriale.

AATM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GOT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AATM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GOT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GOT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AATM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GOT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AATM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AATM nelle cellule tumorali con espressione di GOT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.