14-3-3 ζ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400490-ACT

YWHAZ codifica la proteina adattatrice umana 14-3-3 zeta, un regolatore che si lega alla fosfoserina/fosfotreonina, stabilizza le proteine bersaglio e coordina la trasduzione del segnale in più compartimenti cellulari. La 14-3-3 zeta partecipa alle vie PI3K–AKT, MAPK e al controllo dei checkpoint del ciclo cellulare modulando la localizzazione, lo stato di fosforilazione e l’attività di diverse chinasi, fattori di trascrizione e regolatori dell’apoptosi. Attraverso queste interazioni influenza proliferazione, sopravvivenza, risposte allo stress, dinamiche del citoscheletro e segnalazione metabolica. Una funzione disregolata di YWHAZ/14-3-3 zeta è stata associata ad alterazioni della segnalazione oncogenica, a fenotipi di resistenza alle terapie e a processi neurobiologici rilevanti per la funzione sinaptica e la proteostasi.

14-3-3 ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di YWHAZ senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

14-3-3 ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus YWHAZ nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione YWHAZ, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 14-3-3 ζ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus YWHAZ nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 14-3-3 ζ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 14-3-3 ζ nelle cellule tumorali con espressione di YWHAZ silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.