γENaC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402577-ACT

SCNN1G codifica la subunità γ del canale epiteliale del sodio (γENaC), un canale eterotrimerico sensibile all’amiloride che media l’ingresso elettrogenico di Na⁺ attraverso le membrane apicali in rene, polmone, colon e altri epiteli. La funzione di γENaC si integra con la segnalazione di aldosterone e vasopressina per regolare il trasporto transepiteliale di sali e acqua, influenzando il volume del liquido extracellulare, l’omeostasi del liquido di superficie delle vie aeree e l’equilibrio elettrolitico sistemico. L’attività del canale è controllata dalla processazione proteolitica, dal traffico dipendente dall’ubiquitina mediato da NEDD4-2 e da vie cellulari che regolano la permanenza in membrana e la probabilità di apertura. La disregolazione delle subunità di ENaC, inclusa SCNN1G, è implicata in disturbi della gestione del sale e dell’idratazione delle vie aeree, a supporto di studi meccanicistici nella fisiologia epiteliale e nella biologia del trasporto ionico.

γENaC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCNN1G senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

γENaC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCNN1G nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCNN1G, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di γENaC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCNN1G nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da γENaC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via γENaC nelle cellule tumorali con espressione di SCNN1G silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.