γB-crystallin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402939-ACT

CRYGB codifica la γB-cristallina umana, una proteina strutturale del cristallino altamente abbondante e a lunga emivita, che contribuisce all’indice di rifrazione e alla trasparenza ottica grazie a un impacchettamento proteico denso ma solubile. In quanto membro della superfamiglia delle β/γ-cristalline, la γB-cristallina sostiene l’omeostasi delle cellule delle fibre del cristallino mantenendo la stabilità proteica e resistendo all’aggregazione in condizioni di stress ossidativo e osmotico. L’alterazione della proteostasi delle cristalline è associata alla formazione di aggregati che diffondono la luce e all’opacizzazione del cristallino, e varianti di CRYGB sono state collegate a fenotipi di cataratta ereditaria. Di conseguenza, CRYGB è ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo del cristallino, il ripiegamento/aggregazione proteica e le vie di risposta allo stress che influenzano la trasparenza.

γB-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CRYGB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

γB-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CRYGB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CRYGB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di γB-crystallin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CRYGB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da γB-crystallin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via γB-crystallin nelle cellule tumorali con espressione di CRYGB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.