γ1 Tubulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400327-ACT

TUBG1 codifica la γ1-tubulina umana, un componente fondamentale del complesso ad anello della γ-tubulina che avvia la nucleazione dei microtubuli nei centrosomi e in altri centri di organizzazione dei microtubuli. Supportando l’assemblaggio del fuso mitotico, l’integrità del centrosoma e la progressione del ciclo cellulare, la γ1-tubulina contribuisce a coordinare la segregazione dei cromosomi e una divisione cellulare fedele. Le dinamiche dei microtubuli dipendenti da TUBG1 si intersecano con vie che regolano l’organizzazione del citoscheletro, il traffico intracellulare e i processi di neuro-sviluppo che richiedono una funzione centrosomiale precisa. La deregolazione della nucleazione dei microtubuli e della meccanica del fuso è rilevante per l’instabilità genomica e per fenotipi proliferativi, rendendo TUBG1 un nodo utile per studiare la biologia delle malattie legate alla divisione cellulare.

γ1 Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TUBG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

γ1 Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TUBG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TUBG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di γ1 Tubulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TUBG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da γ1 Tubulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via γ1 Tubulin nelle cellule tumorali con espressione di TUBG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.