β-NAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411126-ACT

Humanes AP3B2 kodiert β-NAP, die in Neuronen angereicherte Beta-Untereinheit des Adapterprotein-Komplexes 3 (AP-3), der die Frachtauswahl und den Transport vom trans-Golgi-Netzwerk sowie aus endosomalen Kompartimenten zu Lysosomen und verwandten Organellen vermittelt. β-NAP unterstützt die Bildung und Zielsteuerung von Vesikeln, die für die Biogenese synaptischer Vesikel und die regulierte Sekretion entscheidend sind, und verknüpft AP3B2 damit mit endolysosomaler Sortierung, der Lokalisation von Membranproteinen und der neuronalen Homöostase. Störungen des AP-3-abhängigen Transports können die Neurotransmitterfreisetzung und die Organellenreifung verändern, wodurch AP3B2 ein relevanter Knotenpunkt für die Untersuchung neuroentwicklungs- und neurodegenerationsassoziierter Mechanismen ist. Expression und Funktion von AP3B2 werden daher häufig als Readouts in Signalwegen genutzt, die vesikulären Transport, synaptische Funktion und endosomal-lysosomale Dynamik betreffen.

β-NAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AP3B2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β-NAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AP3B2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AP3B2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β-NAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AP3B2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β-NAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β-NAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AP3B2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.