βENaC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401371-ACT

SCNN1B codifica la subunità β del canale epiteliale del sodio (βENaC), un componente fondamentale del trasporto di Na⁺ sensibile all’amiloride attraverso le membrane apicali nei tessuti epiteliali. Insieme alle subunità α e γ, βENaC sostiene il riassorbimento di sodio e l’omeostasi dei fluidi, collegando il trasporto ionico alla funzione di barriera dell’epitelio e alle vie di regolazione del volume. L’attività di ENaC è integrata con la processazione proteolitica, il traffico dipendente dall’ubiquitina (inclusa la regolazione mediata da NEDD4L) e la segnalazione responsiva agli ormoni, che modula l’abbondanza del canale e la sua probabilità di apertura. Alterazioni dell’espressione o della funzione di SCNN1B sono state associate a disturbi della gestione del sale e della regolazione dello strato liquido superficiale delle vie aeree, rendendolo rilevante per studi di fisiologia epiteliale e di fenotipi di trasporto ionico associati a malattia.

βENaC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCNN1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

βENaC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCNN1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCNN1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di βENaC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCNN1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da βENaC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via βENaC nelle cellule tumorali con espressione di SCNN1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.