β-casein Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402248-ACT

CSN2 codifica la β-caseina umana, una delle principali proteine del latte sintetizzata dalle cellule epiteliali mammarie differenziate ed è comunemente utilizzata come indicatore della differenziazione lattogenica. L’espressione della β-caseina è regolata da segnali endocrini e citochinici, integrando l’attivazione prolattina–JAK2/STAT5 con le vie dei glucocorticoidi e dell’insulina per coordinare i programmi trascrizionali durante lo sviluppo della ghiandola mammaria. Nei sistemi modello, CSN2 funge da marcatore funzionale dell’attivazione secretoria e della maturazione epiteliale, collegando lo stato della cromatina e l’utilizzo degli enhancer all’espressione genica specifica di linea. La deregolazione di queste reti associate alla differenziazione è rilevante per studi sulla plasticità dell’epitelio mammario, sulle risposte allo stress e sul controllo trascrizionale alterato osservato nella biologia delle patologie della mammella.

β-casein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β-casein Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β-casein. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β-casein nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β-casein nelle cellule tumorali con espressione di CSN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.