Plasmide CRISPR d'Activation (h) β-casein: sc-402248-ACT

CSN2 code la β-caséine humaine, une protéine majeure du lait synthétisée par les cellules épithéliales mammaires différenciées, et couramment utilisée comme marqueur de la différenciation lactogène. L’expression de la β-caséine est régulée par des signaux endocriniens et cytokiniques, intégrant l’activation prolactine–JAK2/STAT5 aux voies des glucocorticoïdes et de l’insuline afin de coordonner les programmes transcriptionnels au cours du développement de la glande mammaire. Dans les systèmes modèles, CSN2 sert de marqueur fonctionnel de l’activation sécrétoire et de la maturation épithéliale, reliant l’état de la chromatine et l’utilisation des enhancers à l’expression génique spécifique de lignée. La dérégulation de ces réseaux associés à la différenciation est pertinente pour l’étude de la plasticité de l’épithélium mammaire, des réponses au stress et des altérations du contrôle transcriptionnel observées dans la biologie des maladies du sein.

β-casein Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CSN2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β-casein Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CSN2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CSN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β-casein. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CSN2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β-casein au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β-casein dans les cellules tumorales présentant une expression de CSN2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.