βB1-crystallin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403361-ACT

CRYBB1 codifica la βB1-cristallina, un importante componente strutturale del cristallino umano che contribuisce all’elevata densità di impacchettamento proteico, all’indice di rifrazione e alla trasparenza a lungo termine. La βB1-cristallina partecipa all’assemblaggio del complesso delle cristalline e alla maturazione delle cellule fibrose del cristallino, processi in cui la proteostasi e la resistenza all’aggregazione sono essenziali per mantenere la chiarezza ottica. La disregolazione dell’espressione di CRYBB1 o della stabilità della proteina è stata associata a opacità del cristallino ereditarie e a fenotipi correlati alla cataratta, rendendolo un bersaglio utile per studiare l’aggregazione proteica, lo sviluppo del cristallino e le vie di risposta allo stress in modelli oculari. La ricerca su CRYBB1 fornisce inoltre indicazioni sui meccanismi di mantenimento delle proteine a lunga vita, sulle modifiche post-traduzionali e sulle interazioni con chaperoni in tessuti terminalmente differenziati.

βB1-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CRYBB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

βB1-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CRYBB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CRYBB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di βB1-crystallin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CRYBB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da βB1-crystallin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via βB1-crystallin nelle cellule tumorali con espressione di CRYBB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.