β3Gn-T1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411554-ACT

B4GAT1 codifica per β3Gn-T1, una glicosiltransferasi che sostiene la sintesi e il rimodellamento dei glicoconiugati catalizzando reazioni di trasferimento di β1,3-N-acetilglucosamina che contribuiscono all’allungamento delle catene di glicani. Attraverso il suo ruolo nella glicosilazione di proteine e lipidi, β3Gn-T1 influenza il traffico di membrana, l’organizzazione dei recettori e le interazioni con la matrice extracellulare che modellano la comunicazione cellula-cellula e la segnalazione dipendente dall’adesione. Programmi di glicosilazione alterati che coinvolgono B4GAT1 sono stati studiati in contesti di regolazione dello sviluppo e di cambiamenti nella composizione dei glicani associati a patologie, in cui variazioni nelle glicoproteine di superficie possono influire sul riconoscimento immunitario e sulle reti di segnalazione. Queste caratteristiche rendono B4GAT1 un bersaglio utile per studiare la modulazione di vie dipendenti dalla glicosilazione e i fenotipi legati ai glicani di superficie cellulare.

β3Gn-T1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di B4GAT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β3Gn-T1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus B4GAT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione B4GAT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β3Gn-T1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus B4GAT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β3Gn-T1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β3Gn-T1 nelle cellule tumorali con espressione di B4GAT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.