β2B Tubulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400059-ACT

TUBB2B codifica la β2B-tubulina umana, un’isotipia di β-tubulina arricchita nei neuroni che eterodimerizza con l’α-tubulina per formare microtubuli a supporto dell’architettura del citoscheletro, del trasporto intracellulare e della dinamica del fuso mitotico. Nel sistema nervoso in sviluppo e in quello maturo, la β2B-tubulina contribuisce alla crescita dei neuriti, alla guida assonale e alla migrazione neuronale tramite processi dipendenti dai microtubuli e in coordinamento con le proteine motrici e le proteine associate ai microtubuli. La dinamica dei microtubuli, regolata dalla composizione isotipica della tubulina, si interseca con vie che controllano polarità e divisione cellulare, incluse la segnalazione delle GTPasi Rho e l’organizzazione mediata dal centrosoma. Varianti patogene o un’espressione deregolata di TUBB2B sono state associate a disturbi del neurosviluppo caratterizzati da un’alterata organizzazione corticale e da una compromessa differenziazione neuronale, rendendolo rilevante per studi meccanicistici in modelli neuronali.

β2B Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TUBB2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β2B Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TUBB2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TUBB2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β2B Tubulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TUBB2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β2B Tubulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β2B Tubulin nelle cellule tumorali con espressione di TUBB2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.