β-1,3-Gal-T5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409777-ACT

B3GALT5 codifica la β-1,3-Gal-T5, una β1,3-galattosiltransferasi residente nell’apparato di Golgi che contribuisce alla sintesi e all’estensione di glicolipidi e glicoproteine aggiungendo galattosio con legame β1,3 ad accettori contenenti N-acetilglucosamina. Attraverso il suo ruolo nella glicosilazione, la β-1,3-Gal-T5 influenza la composizione dei glicani sulla superficie cellulare, che regola il traffico delle proteine, l’organizzazione dei recettori e le interazioni cellula–cellula mediate da lectine. Un’attività alterata di B3GALT5 può modificare programmi di segnalazione e di adesione dipendenti dai glicani, coinvolti nel riconoscimento immunitario, nella differenziazione epiteliale e nei fenotipi di glicosilazione associati ai tumori. Di conseguenza, B3GALT5 rappresenta un bersaglio utile per analizzare come le reti di glicosiltransferasi regolino la biologia di membrana e i cambiamenti del comportamento cellulare rilevanti per la malattia.

β-1,3-Gal-T5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di B3GALT5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β-1,3-Gal-T5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus B3GALT5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione B3GALT5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β-1,3-Gal-T5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus B3GALT5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β-1,3-Gal-T5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β-1,3-Gal-T5 nelle cellule tumorali con espressione di B3GALT5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.