α_1B-AR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403295-ACT

ADRA1B codifica l’α1B-AR (recettore adrenergico alfa-1B) umano, un GPCR responsivo alle catecolamine che si accoppia principalmente alle proteine Gq/11 per attivare la fosfolipasi C, la segnalazione tramite fosfati dell’inositolo, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare e vie dipendenti dalla protein chinasi C. L’attivazione del recettore può inoltre coinvolgere la segnalazione MAPK/ERK e regolare la dinamica del citoscheletro, la secrezione e le risposte contrattili nei tessuti innervati adrenergicamente. L’α1B-AR contribuisce al controllo del tono vascolare e della reattività della muscolatura liscia e influenza l’eccitabilità neuronale e la segnalazione responsiva allo stress. La disregolazione della segnalazione adrenergica che coinvolge ADRA1B è studiata nel contesto della fisiologia cardiovascolare, di fenotipi neuropsichiatrici e di alterazioni della segnalazione proliferativa in sistemi modello.

α1B-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADRA1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α1B-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADRA1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADRA1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α1B-AR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADRA1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α1B-AR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α1B-AR nelle cellule tumorali con espressione di ADRA1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.