α-actinin-1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-430958-LAC

Actn1 codifica l’α-actinina-1, una proteina legante l’actina insensibile al calcio che reticola l’F-actina in fasci e ancora i filamenti del citoscheletro ai complessi di adesione. Nelle cellule di topo, l’α-actinina-1 contribuisce all’organizzazione del citoscheletro, alla forma cellulare e alla meccanotrasduzione coordinando il rimodellamento dell’actina con la dinamica delle adesioni focali e con reti di segnalazione quali le vie delle GTPasi della famiglia Rho. Attraverso queste funzioni, influenza la migrazione cellulare, la stabilità della membrana e l’architettura di strutture actiniche contrattili e non muscolari. Un’attività o un’espressione alterata dell’α-actinina-1 è rilevante per la ricerca su disfunzioni del citoscheletro, fenotipi legati all’adesione e patologie in cui l’integrità della rete di actina e la motilità cellulare risultano compromesse.

Le particelle di attivazione lentivirale α-actinin-1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Actn1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale α-actinin-1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Actn1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di α-actinin-1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Actn1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.