Zic2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404720-ACT

ZIC2 codifica il fattore di trascrizione a dita di zinco Zic2, un regolatore chiave della definizione dei pattern embrionali precoci e dei programmi genici del neurosviluppo. Zic2 si lega a elementi cis-regolatori per controllare reti trascrizionali coinvolte nella formazione del tubo neurale, nella specificazione del proencefalo e nella determinazione del destino cellulare, intersecandosi con vie di segnalazione che modellano le risposte ai morfogeni e le transizioni dello stato della cromatina. Un’espressione o una funzione deregolata di ZIC2 è stata associata a disturbi dello sviluppo, inclusa l’oloprosencefalia, e un’alterazione dei circuiti trascrizionali che coinvolgono ZIC2 è stata riportata in molteplici contesti oncologici. In quanto regolatore che si lega al DNA, Zic2 rappresenta un nodo adatto per esplorare reti di regolazione genica, specificazione di linea e fenotipi guidati da fattori di trascrizione in modelli cellulari umani.

Zic2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZIC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Zic2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZIC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZIC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Zic2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZIC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Zic2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Zic2 nelle cellule tumorali con espressione di ZIC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.