Wnt-7a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401188-ACT

WNT7A codifica per la glicoproteina secreta Wnt-7a, un ligando chiave della segnalazione Wnt che regola la specificazione del destino cellulare, la proliferazione, la polarità e la migrazione durante lo sviluppo e l’omeostasi dei tessuti nell’adulto. Wnt-7a può interagire con i recettori Frizzled/LRP per attivare la trascrizione dipendente da β-catenina, così come vie non canoniche che influenzano l’organizzazione del citoscheletro e la polarità planare delle cellule. Nella biologia umana, WNT7A è particolarmente rilevante per la morfogenesi degli arti, le interazioni epitelio-mesenchimali e la regolazione dell’architettura tissutale; la disregolazione della segnalazione Wnt è ampiamente implicata in malformazioni congenite e in processi oncogenici. La modulazione dell’espressione di WNT7A è quindi utile per analizzare il cross-talk tra vie di segnalazione e programmi trascrizionali dipendenti dal contesto controllati dai ligandi Wnt.

Wnt-7a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WNT7A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-7a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WNT7A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WNT7A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-7a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WNT7A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-7a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-7a nelle cellule tumorali con espressione di WNT7A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.