VGF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402030-ACT

VGF codifica una proteina dei granuli secretori neuroendocrini che viene processata proteoliticamente in peptidi bioattivi in grado di regolare la plasticità sinaptica, il bilancio energetico e la segnalazione neuroendocrina. Nei neuroni e nelle cellule endocrine, i peptidi derivati da VGF influenzano programmi trascrizionali dipendenti dall’attività e vie di segnalazione intracellulari legate a secrezione, metabolismo e risposte allo stress. L’espressione di VGF risponde a segnali di neurotrofine e all’attività neuronale ed è spesso studiata nel contesto di circuiti che controllano il comportamento alimentare e fenotipi correlati all’umore. Un’alterata segnalazione di VGF è stata associata a processi rilevanti per malattie neuropsichiatriche e metaboliche, supportandone l’uso come nodo meccanicistico negli studi di interrogazione delle vie di segnalazione.

VGF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VGF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VGF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VGF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VGF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VGF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VGF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VGF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VGF nelle cellule tumorali con espressione di VGF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.