V-ATPase B2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401896-ACT

ATP6V1B2 codifica la subunità B2 del dominio periferico V1 della H+-ATPasi vacuolare (V-ATPasi), una pompa protonica multisubunità che idrolizza ATP per acidificare endosomi, lisosomi e altri compartimenti intracellulari. Questa acidificazione degli organelli è essenziale per l’endocitosi mediata da recettore, il flusso autofagico, l’attivazione degli enzimi lisosomiali e il traffico vescicolare, e influenza indirettamente il sensing dei nutrienti e l’adattamento metabolico legato a mTOR. Regolando il pH luminale, l’attività della V-ATPasi condiziona la maturazione e il turnover proteico, la processazione degli antigeni e il riciclo delle proteine di membrana. La disregolazione dei percorsi di acidificazione di vescicole e lisosomi che coinvolgono componenti della V-ATPasi è stata associata a fenotipi di neurosviluppo e neurologici e, più in generale, a disturbi del traffico intracellulare, rendendo ATP6V1B2 un nodo utile per studiare la proteostasi e la disfunzione endolisosomiale.

V-ATPase B2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP6V1B2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

V-ATPase B2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP6V1B2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V1B2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di V-ATPase B2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP6V1B2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da V-ATPase B2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via V-ATPase B2 nelle cellule tumorali con espressione di ATP6V1B2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.