UFL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407950-ACT

UFL1 codifica una ligasi E3 che catalizza l’UFMilazione (UFMylation), una via di modifica simile all’ubiquitina importante per l’omeostasi del reticolo endoplasmatico e per la proteostasi. Coordinando la coniugazione di UFM1 a substrati specifici, UFL1 influenza la segnalazione dello stress del RE, il controllo qualità delle proteine e vie legate alla sorveglianza associata ai ribosomi e alla gestione delle proteine secretorie. In letteratura, un’alterazione dell’attività di UFL1 è stata associata a risposte cellulari allo stress e a segnali infiammatori deregolati, fornendo un collegamento meccanicistico a fenotipi rilevanti per la malattia in tessuti con un’elevata richiesta di ripiegamento proteico. Di conseguenza, UFL1 viene spesso studiata in modelli che indagano l’adattamento allo stress del RE, la sopravvivenza cellulare sotto stress proteotossico e il crosstalk tra i modificatori ubiquitina-like e la regolazione dell’immunità innata.

UFL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UFL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UFL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UFL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UFL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UFL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UFL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UFL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UFL1 nelle cellule tumorali con espressione di UFL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.