Plasmide CRISPR d'Activation (h) UBE2B: sc-404361-ACT

UBE2B (enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2 B) est une enzyme humaine de conjugaison de l’ubiquitine de type E2 qui coopère avec des ligases E3 pour catalyser le transfert d’ubiquitine vers des protéines substrats, façonnant la protéostasie via le système ubiquitine–protéasome. Elle contribue au renouvellement régulé des protéines et au contrôle de la signalisation, avec des rôles établis dans les réponses aux dommages de l’ADN et dans des processus associés à la chromatine, notamment des événements d’ubiquitination qui influencent le choix des voies de réparation. Par ces activités, UBE2B influence la progression du cycle cellulaire, la stabilité du génome et les réseaux de signalisation du stress. Une ubiquitination dérégulée et une capacité de réparation de l’ADN altérée sont largement pertinentes pour l’oncogenèse et d’autres troubles liés à une protéostasie et une maintenance du génome déficientes, faisant d’UBE2B un nœud utile pour les études mécanistiques.

UBE2B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBE2B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UBE2B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBE2B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBE2B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UBE2B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBE2B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UBE2B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UBE2B dans les cellules tumorales présentant une expression de UBE2B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.