Tyrosinase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400255-ACT

Il gene umano **TYR** codifica la tirosinasi, un’ossidasi rame-dipendente che catalizza i passaggi limitanti della melanogenesi convertendo la L-tirosina in L-DOPA e in DOPAchinone, promuovendo in ultima analisi la sintesi di eumelanina e feomelanina nei melanosomi. L’attività di **TYR** si integra con i programmi di biogenesi e traffico dei melanosomi ed è coordinata con le reti trascrizionali delle cellule pigmentarie, influenzando l’equilibrio redox cellulare e le vie di risposta allo stress indotte dai raggi UV. Alterazioni della funzione di **TYR** sono associate a fenotipi di pigmentazione e a disturbi legati alla melanina, e **TYR** è spesso utilizzato come readout molecolare per la differenziazione dei melanociti e la maturazione dei melanosomi. In quanto enzima a espressione ristretta alla linea cellulare, la tirosinasi rappresenta anche un modello utile per studiare l’enzimologia specifica degli organelli e la secrezione regolata nelle cellule pigmentarie.

Tyrosinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TYR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tyrosinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TYR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TYR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tyrosinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TYR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tyrosinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tyrosinase nelle cellule tumorali con espressione di TYR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.