Plásmido CRISPR de Activación (h) Tyrosinase: sc-400255-ACT

El gen humano **TYR** codifica la tirosinasa, una oxidasa dependiente de cobre que cataliza las etapas limitantes de la velocidad de la melanogénesis al convertir la L-tirosina en L-DOPA y DOPAquinona, impulsando en última instancia la síntesis de eumelanina y feomelanina en los melanosomas. La actividad de **TYR** se integra con los programas de biogénesis y tráfico de melanosomas y se coordina con redes transcripcionales de células pigmentarias, influyendo en el equilibrio redox celular y en las vías de respuesta al estrés inducidas por UV. La alteración de la función de **TYR** se asocia con fenotipos de pigmentación y trastornos relacionados con la melanina, y se utiliza con frecuencia como lectura molecular del estado de diferenciación de los melanocitos y de la maduración de los melanosomas. Como enzima restringida a un linaje celular, la tirosinasa también sirve como un modelo útil para estudiar la enzimología específica de orgánulos y la secreción regulada en células pigmentarias.

Tyrosinase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TYR sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Tyrosinase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TYR en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TYR, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Tyrosinase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TYR y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Tyrosinase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Tyrosinase en células tumorales con expresión de TYR silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.