TRβ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401467-ACT

THRB codifica il recettore beta degli ormoni tiroidei (TRβ), un recettore nucleare ligando-dipendente che lega la triiodotironina (T3) e regola la trascrizione attraverso elementi di risposta agli ormoni tiroidei. TRβ coordina programmi genici che controllano il metabolismo cellulare, la funzione mitocondriale, l’omeostasi lipidica e dei carboidrati e la differenziazione dello sviluppo, tramite interazioni con coregolatori e crosstalk con RXR e con le vie di segnalazione MAPK/PI3K. Un’attività alterata di THRB è associata a una segnalazione endocrina deregolata e a fenotipi metabolici, e le perturbazioni delle reti trascrizionali mediate da TRβ sono studiate in contesti quali la resistenza agli ormoni tiroidei e i tumori ormono-responsivi. Nelle cellule umane, TRβ funge da fattore di trascrizione modello per investigare l’occupazione della cromatina da parte dei recettori nucleari, la dipendenza dai cofattori e la regolazione genica in risposta a stimoli.

TRβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di THRB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus THRB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione THRB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRβ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus THRB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRβ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRβ nelle cellule tumorali con espressione di THRB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.