TERT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400316-ACT

Il gene umano TERT codifica la telomerasi reverse transcriptase, la subunità catalitica della telomerasi che estende le ripetizioni telomeriche per mantenere l’integrità delle estremità cromosomiche e consentire una capacità replicativa a lungo termine. L’attività di TERT si coordina con la rete di mantenimento dei telomeri, inclusa la regolazione del complesso shelterin, le risposte allo stress della replicazione del DNA e le vie di segnalazione del danno al DNA, come ATM/ATR, che vengono attivate quando i telomeri diventano disfunzionali. Un’espressione deregolata della telomerasi contribuisce ad alterazioni della senescenza cellulare, all’instabilità genomica e a fenotipi di immortalizzazione, mentre perturbazioni ereditarie o acquisite della biologia dei telomeri sono associate a diversi disturbi caratterizzati da un accorciamento precoce dei telomeri. In quanto nodo centrale dell’omeostasi telomerica, TERT è ampiamente studiato in modelli di autorinnovamento delle cellule staminali, invecchiamento replicativo e mantenimento del genoma guidato dai telomeri.

TERT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TERT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TERT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TERT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TERT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TERT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TERT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TERT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TERT nelle cellule tumorali con espressione di TERT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.