Syntaxin 5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402516-ACT

STX5 umano codifica la sintaxina 5, una Qa-SNARE centrale che media l’ancoraggio delle vescicole e la fusione di membrana all’interno della via secretoria precoce, supportando il trasporto dal reticolo endoplasmatico (RE) all’apparato di Golgi e il traffico intra-Golgi. Coordinando l’assemblaggio del complesso SNARE al cis-Golgi e nel compartimento intermedio RE–Golgi, STX5 contribuisce a mantenere l’organizzazione del Golgi, la glicosilazione proteica e la secrezione polarizzata. L’alterazione del traffico dipendente da STX5 può compromettere la proteostasi e la maturazione dei glicani, influenzando i processi che regolano la maturazione dei recettori, la localizzazione delle proteine di membrana e la gestione del carico secretorio. In letteratura, una funzione anomala della via secretoria che coinvolge STX5 è stata associata a risposte di stress cellulare e a fenotipi rilevanti per i disordini congeniti della glicosilazione e, più in generale, per meccanismi patologici legati al traffico intracellulare.

Syntaxin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STX5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Syntaxin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STX5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STX5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Syntaxin 5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STX5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Syntaxin 5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Syntaxin 5 nelle cellule tumorali con espressione di STX5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.