Sororin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403556-ACT

CDCA5 codifica Sororin, un regolatore conservato della coesione tra cromatidi fratelli che stabilizza i complessi di coesina sul DNA replicato durante la fase S e garantisce un’accurata segregazione dei cromosomi in mitosi. L’attività di Sororin è coordinata con la segnalazione del ciclo cellulare, inclusa la proteolisi mediata da APC/C e l’antagonismo del rilascio della coesina mediato da WAPL, collegandola all’instaurazione e al mantenimento della coesione accoppiati alla replicazione. Grazie al suo ruolo centrale nella stabilità del genoma, Sororin favorisce una riparazione del DNA fedele e le risposte allo stress replicativo, processi spesso alterati nei disturbi proliferativi. Un’espressione alterata di CDCA5 è stata associata a una progressione disregolata del ciclo cellulare e a fenotipi correlati all’aneuploidia, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici dell’instabilità cromosomica.

Sororin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDCA5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sororin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDCA5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDCA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sororin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDCA5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sororin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sororin nelle cellule tumorali con espressione di CDCA5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.