SMC3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403950-ACT

SMC3 codifica una proteina strutturale fondamentale per il mantenimento dei cromosomi che, insieme a SMC1A e ad altre subunità associate, forma il complesso della coesina per stabilire la coesione tra cromatidi fratelli durante la fase S e garantire una corretta segregazione dei cromosomi. Oltre alla mitosi, le dinamiche della coesina dipendenti da SMC3 regolano la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA, la stabilità delle forcelle di replicazione e l’organizzazione di ordine superiore del genoma, che influenza la comunicazione tra enhancer e promotore e i programmi trascrizionali. Queste funzioni collocano SMC3 al centro delle vie che controllano la stabilità genomica e la progressione del ciclo cellulare, e la sua deregolazione è associata a fenotipi di instabilità cromosomica e a disturbi dello sviluppo correlati alla coesina. In biologia del cancro, l’alterazione dell’attività della coesina che coinvolge SMC3 è spesso studiata per i suoi effetti su aneuploidia, capacità di riparazione del DNA e riprogrammazione trascrizionale.

SMC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMC3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMC3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMC3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMC3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMC3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMC3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMC3 nelle cellule tumorali con espressione di SMC3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.