SLC5A8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403705-ACT

SLC5A8 (nota anche come SMCT1) codifica un trasportatore di monocarbossilati accoppiato al sodio che media l’assorbimento di acidi grassi a catena corta e di altri monocarbossilati, come lattato, piruvato e nicotinato, attraverso la membrana plasmatica. Regolando la disponibilità intracellulare di questi metaboliti, SLC5A8 collega il trasporto di membrana al metabolismo energetico cellulare e al controllo epigenetico, includendo vie influenzate dagli acidi grassi a catena corta che inibiscono le deacetilasi istoniche (HDAC). La sua espressione è frequentemente alterata nella biologia dei tumori e in modelli di cellule epiteliali, dove l’attività del trasportatore può influenzare la riprogrammazione metabolica, i programmi di differenziamento e le risposte allo stress. SLC5A8 è inoltre rilevante negli studi sul sensing dei nutrienti e sulla fisiologia dei tessuti barriera, dato il suo ruolo nella gestione dei monocarbossilati presenti nel lume.

SLC5A8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC5A8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLC5A8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC5A8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC5A8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLC5A8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC5A8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLC5A8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLC5A8 nelle cellule tumorali con espressione di SLC5A8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.