Six2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402975-ACT

SIX2 codifica il fattore di trascrizione homeobox Six2, un regolatore dello sviluppo che mantiene l’identità delle cellule progenitrici e controlla i programmi di specificazione di linea. Nei tessuti umani, le reti trascrizionali guidate da Six2 influenzano la differenziazione mesenchimale, le interazioni epitelio–mesenchimali e le vie associate all’organogenesi, con effetti a valle sulla tempistica del ciclo cellulare e sul mantenimento dello stato della cromatina. Un’espressione deregolata di SIX2 è stata collegata ad alterazioni dei programmi genici dello sviluppo ed è stata riportata in contesti di proliferazione e differenziazione aberranti, rendendola rilevante per studi meccanicistici sui disturbi dello sviluppo e sul rimodellamento oncogenico dei programmi trascrizionali. In quanto regolatore che si lega al DNA, Six2 è spesso utilizzato come nodo per interrogare i circuiti di controllo trascrizionale e le decisioni di destino cellulare in modelli di cellule staminali e progenitrici.

Six2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SIX2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Six2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SIX2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SIX2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Six2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SIX2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Six2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Six2 nelle cellule tumorali con espressione di SIX2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.