SCOT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404705-ACT

L’OXCT1 umano codifica la succinil-CoA:3-oxoacido CoA transferasi (SCOT), un enzima mitocondriale che catalizza la tappa limitante della velocità nell’utilizzo dei corpi chetonici convertendo l’acetoacetato in acetoacetil-CoA, permettendone l’ingresso nel metabolismo dell’acetil-CoA e del ciclo dell’acido citrico (TCA). L’attività di SCOT collega la chetolisi alla bioenergetica cellulare, all’equilibrio redox e alla flessibilità metabolica nei tessuti che ossidano i corpi chetonici durante il digiuno o in condizioni di elevata richiesta energetica. La funzione di OXCT1 è integrata con l’ossidazione degli acidi grassi e con il flusso mitocondriale di acetil-CoA, influenzando vie a valle come la fosforilazione ossidativa e l’anaplerosi. Alterazioni genetiche o una disregolazione del metabolismo dei corpi chetonici che coinvolga OXCT1 sono state associate a fenotipi di disfunzione metabolica, supportandone l’impiego come bersaglio in studi sul metabolismo mitocondriale e sul nutrient sensing.

SCOT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OXCT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SCOT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OXCT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OXCT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SCOT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OXCT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SCOT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SCOT nelle cellule tumorali con espressione di OXCT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.