RPA194 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400816-ACT

POLR1A codifica RPA194, la maggiore subunità catalitica dell’RNA polimerasi I, che nel nucleolo guida la sintesi dell’RNA ribosomiale (pre-rRNA 47S), una tappa limitante per la biogenesi dei ribosomi e per la capacità del proteoma. La funzione di RPA194 si integra con l’organizzazione nucleolare, il controllo della trascrizione dell’rDNA e i programmi di crescita cellulare, collegando i segnali di nutrienti e di stress all’output traduttivo. L’alterazione della trascrizione mediata da Pol I può indurre stress nucleolare e attivare vie di sorveglianza dipendenti e indipendenti da p53, collegando la regolazione di POLR1A alla stabilità genomica e al controllo del ciclo cellulare. Una biogenesi ribosomiale aberrante e un’attività di Pol I modificata sono associate a fenotipi proliferativi e a stati rilevanti per la malattia, in cui la domanda di sintesi proteica e la funzione del nucleolo vengono rimodellate.

RPA194 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLR1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RPA194 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLR1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLR1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RPA194. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLR1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RPA194 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RPA194 nelle cellule tumorali con espressione di POLR1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.