RNF43 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403797-ACT

RNF43 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING che funge da regolatore negativo della segnalazione Wnt/β-catenina promuovendo l’ubiquitinazione e il turnover dei recettori Frizzled, limitando così l’abbondanza dei recettori Wnt sulla membrana plasmatica. Attraverso questa funzione, RNF43 contribuisce a controllare l’omeostasi epiteliale, la segnalazione delle cellule staminali e i programmi proliferativi sensibili all’intensità della via Wnt. Un’alterata attività di RNF43 è stata collegata a una segnalazione Wnt deregolata e a contesti genomici associati alla biologia tumorale gastrointestinale e pancreatica, rendendolo rilevante per studi sulla dipendenza dalla via e sui circuiti di feedback della segnalazione. RNF43 viene inoltre utilizzato come punto di ingresso molecolare per indagare la regolazione, mediata dall’ubiquitina, del traffico recettoriale e il cross-talk tra vie di segnalazione.

RNF43 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF43 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF43 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF43 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF43, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF43. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF43 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF43 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF43 nelle cellule tumorali con espressione di RNF43 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.