Rb Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400116-ACT

RB1 umano codifica la proteina del retinoblastoma (Rb), un soppressore tumorale centrale che governa il checkpoint G1/S legandosi ai fattori di trascrizione E2F e coordinando l’espressione dei geni del ciclo cellulare. L’attività di Rb è regolata dalla fosforilazione mediata da ciclina D–CDK4/6 e ciclina E–CDK2, collegando i segnali mitogeni all’ingresso nella replicazione del DNA, al rimodellamento della cromatina e ai programmi di differenziamento. Oltre al controllo del ciclo cellulare, RB1 influenza la stabilità del genoma, la senescenza e la repressione trascrizionale attraverso interazioni con modificatori degli istoni e complessi SWI/SNF. L’alterazione della segnalazione della via di RB1 è ampiamente associata a una proliferazione deregolata ed è frequentemente implicata nei tumori e in altri disturbi proliferativi, rendendo RB1 un nodo chiave per studi meccanicistici sul controllo del ciclo cellulare.

Rb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rb. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rb nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rb nelle cellule tumorali con espressione di RB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.