Rab 10 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422551-ACT

Rab10 codifica Rab10, una piccola GTPasi correlata a Ras che coordina il traffico di membrana regolando la gemmazione, il trasporto, l’ancoraggio e la fusione delle vescicole tra endosomi, vie di riciclo e rete trans del Golgi. Nelle cellule di topo, l’attività di Rab10 supporta l’esocitosi polarizzata, il traffico delle vescicole di GLUT4, la maturazione degli autofagosomi e il riciclo dei recettori, collegandola alla segnalazione PI3K–AKT, allo smistamento endosomiale e alla dinamica del citoscheletro. L’alterazione del traffico dipendente da Rab10 è stata associata a modifiche della sensibilità all’insulina, della funzione delle cellule immunitarie e dell’omeostasi neuronale, rendendo Rab10 un nodo utile per studiare in vivo e in modelli in coltura vie rilevanti per il metabolismo e la neurodegenerazione.

Rab 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rab10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rab10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rab10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rab10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 10 nelle cellule tumorali con espressione di Rab10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.