PYGB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406294-ACT

Il gene umano **PYGB** codifica l’isoforma cerebrale della glicogeno fosforilasi, un enzima limitante della velocità che catalizza la degradazione del glicogeno per generare glucosio-1-fosfato e sostenere l’apporto energetico cellulare. Collegando la mobilizzazione del glicogeno alla glicolisi e, più in generale, al metabolismo dei carboidrati, **PYGB** supporta la flessibilità metabolica durante variazioni della disponibilità di nutrienti o di ossigeno. L’attività di **PYGB** si interseca con reti di segnalazione che regolano l’omeostasi energetica, inclusi il sensing di AMP/ATP e vie responsabili allo stress che influenzano la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Un metabolismo del glicogeno deregolato e un’espressione alterata di **PYGB** sono stati osservati in contesti di adattamento metabolico e di rimodellamento dell’utilizzo energetico associato al cancro, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici della bioenergetica.

PYGB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PYGB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PYGB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PYGB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PYGB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PYGB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PYGB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PYGB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PYGB nelle cellule tumorali con espressione di PYGB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.